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Emsdiasum常見問題解答
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Emsdiasum產(chǎn)品-緩沖液
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我應該使用什么樣的粒度？
始終使用最小的顆粒大小來適合您的應用?；谳^小顆粒的共軛比基于較大顆粒的共軛更有效。如果使用較小的粒子難以顯示，則可以使用銀增強來放大這些粒子，這是Ultra Small系列共軛物的備條件。新的銀增強系統(tǒng)AURION SE-EM提供均勻高效的增強。
金綴合物真的比其他綴合物更傾向于背景嗎？
不這個童話故事來源于這樣一個事實，即金共軛物是基于粒子的，而可視化也是基于單獨的粒子的。與酶和熒光標記相反，金綴合物更像一個數(shù)字系統(tǒng)，要么它們在那里，然后你會看到它們，要么它們不存在。酶和熒光標記很快被認為是“類似物"標記，它們在檢測中的可見度隨著其局部濃度或酶標記產(chǎn)生可見反應產(chǎn)物的時間而增加。對熒光對照的無偏見觀察顯示，生物化合物中存在雙鍵所固有的低水平光，最重要的是來自標記抗體的熒光。同樣，對僅用堿性磷酸酶或過氧化物酶標記的抗體孵育的對照樣品進行無偏見的觀察，通常會顯示出樣品的整體染色微弱。這種微弱的水平很容易被接受，甚至在心理上被過濾掉。你不能用金共軛物做這件事，因為它們是基于粒子的。
我應該使用二級金綴合物或蛋白a（或G）嗎？
這取決于你的目標是什么。使用次級綴合物會產(chǎn)生更高的標記密度。因此，人們常說次級綴合物比蛋白A綴合物更敏感。這在一定程度上是正確的。蛋白質(zhì)A（或G）僅識別一級抗體分子上的一個位點。只有當此站點可用且不被其環(huán)境遮擋時，才會發(fā)生綁定。次級綴合物識別初級上更多的位點，因此檢測到初級抗體的可能性更大。本質(zhì)上，這是靈敏度的提高。
有沒有免疫金（銀）染色的培訓計劃，我可以自己帶標本？
EMS和Aurion組織濕式工作坊，您最好使用自己的樣本和初級抗體。畢竟，這就是你的興趣所在。如果需要，我們將把活動擴展到其他場地。研討會持續(xù)兩三天，對免疫金（銀）染色進行了深入探討。參與者人數(shù)有限，以保證最佳教學。您可以直接聯(lián)系我們了解更多信息。有關我們研討會設置的詳細信息，請訪問本網(wǎng)站。
有可能對細胞內(nèi)抗原進行預包埋標記嗎？
對單細胞是最合適的。植物材料有一層厚厚的不可穿透的墻，而不是。超小型金綴合物是選的綴合物。在許多情況下，NaBH4的滲透步驟足以打開樣品并允許試劑滲透。低濃度的溫和清潔劑，如皂苷，有助于清潔。需要強調(diào)的一點是：必須延長反應時間，因為必須實現(xiàn)試劑對內(nèi)部抗原的全滲透。為了在孵育后去除未反應的試劑，必須同樣調(diào)整洗滌程序！《Aurion通訊》第5期討論了這個話題。請參閱本網(wǎng)站的其他地方。
如何驗證我的綴合物是否仍然有效？
有一個簡單的程序來檢查這一點。它在Aurion的通訊#4中有非常詳細的描述，一些信息可以在本網(wǎng)站的“通訊"部分找到。簡而言之：你需要一個硝基纖維素條，從一級抗體的稀釋系列中涂上點，然后用金試劑孵育條。這些點會被較大的共軛物染成紅色。測試超小型共軛銀時，必須應用銀增強進行可視化。
如何驗證銀增強試劑是否仍然正常？
同樣，有一個簡單的過程來檢查這一點。它在我們的第4號通訊中有詳細描述（請參閱本網(wǎng)站的“通訊"部分）。簡言之：你需要一個硝基纖維素條，從你的金綴合物的稀釋系列中涂上點，然后用銀增強試劑孵育條。圓點應變成棕黑色。在這段時間內(nèi)，試劑混合物應保持玻璃透明，無任何由自成核引起的可見銀存在。
電子顯微鏡用銀增強試劑SE-EM的活性可以通過向100µl增強混合物中加入10µl稀釋的超小型試劑來測試。溶液應在30-45分鐘內(nèi)變黃。
建議使用過時的共軛詞嗎？
只要它們的反應性良好，并且沒有形成太多的團簇，這就沒有問題。金共軛物非常穩(wěn)定。隨著時間的推移，可能會有一些蛋白質(zhì)從顆粒表面釋放，但通常這不會導致反應性顯著降低。如通訊#4所述，結(jié)合物的反應性很容易通過點點測試進行檢查。根據(jù)結(jié)合蛋白的類型和顆粒大小，簇的形成可能會隨著時間的推移而增加。粒子越大，簇越多。這些可以在使用前通過離心稀釋的綴合物來去除。
是否可以使用來自同一動物源的兩種抗體進行雙重標記？
是的，有辦法做到這一點。一種是通過使用具有不同粒徑的蛋白G或蛋白A綴合物。程序是：首先用一級抗體I孵育，用粒徑較小的蛋白A（或G）檢測。然后加入過量游離蛋白A或G（50-100µG/ml）孵育。這將幾乎阻斷蛋白A或G的所有結(jié)合位點。接下來，用一級抗體II孵育第二種抗原，并用更大尺寸的A或G蛋白金綴合物檢測。第二種可能性是用一級抗體的混合物進行一步孵育，每個抗體直接用不同的金粒徑標記。可提供定制標簽服務。
我應該使用什么樣的網(wǎng)格進行銀色增強？
鎳是選材料。黃金網(wǎng)格是不可能的，因為它們也將被整齊地增強。銅也是如此。無論如何，鎳網(wǎng)格比銅網(wǎng)格更適合免疫培養(yǎng)，因為鎳對免疫或酶反應更具惰性，毒性更小。鎳網(wǎng)格由于其磁性而令人討厭。通過使用非磁性鑷子或使用電子顯微鏡科學“美回路"在免疫培養(yǎng)期間將網(wǎng)格從液滴轉(zhuǎn)移到液滴，可以很容易地克服這一問題。
銀增強和OsO4怎么樣？
OsO4固定可在孵育前、孵育后或銀增強后使用。
由于其對抗原OsO4的破壞作用，當打算進行免疫培養(yǎng)時，通常不使用固定。然而，一般來說，銀增強免疫孵育的OsO4固定標本不會造成任何困難。
孵育后可引入鋨固定步驟，以提高樣品的對比度。如前所述，應用銀增強通常不會造成任何困難。
增強后使用OsO4固定也是可能的，但由于OsO5是一種強氧化劑，它能夠氧化金屬銀，特別是當以顆粒形式存在時。這導致部分銀被去除。一種簡單的補救方法是將稍微增強的樣品與有限的OsO4固定相結(jié)合，例如1%OsO5分鐘。
我沒有得到積極的結(jié)果，現(xiàn)在怎么辦？
當孵育的標本看起來和對照一樣干凈時，要么（一種或多種）試劑不活躍，要么抗原被破壞、掩蓋或缺失。如通訊#4（請參閱本網(wǎng)站的“通訊"部分）中所述，通過使用點點測試反向進行孵化協(xié)議測試，很容易找到原因。
首先測試所用金綴合物上的銀增強試劑（如果使用的話）的活性。如果銀增強是好的，下一步是在使用的一級抗體上測試金綴合物，等等。如果它證明問題不在試劑中，你將不得不研究抗原保存。是否應進行不同的固定？或者不同的嵌入介質(zhì)？使用光顯微鏡對結(jié)果進行評估，無需繁瑣的EM實驗工作即可回答這些問題。
我有背景問題；這是因為金共軛嗎？
當標本被正確阻斷并且使用了正確的培養(yǎng)緩沖液成分和條件時，背景水平不應干擾特定信號。某些背景總是存在的：在某種程度上，所有化合物對其他化合物都有一定的親和力，根據(jù)可用性和濃度，可能會發(fā)生相互作用。在這方面沒有絕對的黑白之分。
當你放棄了一級抗體培養(yǎng)，只使用黃金步驟，而你的背景已經(jīng)大大降低，那么你的一級抗體就會導致背景。補救措施：通過親和層析（抗血清）和/或交叉吸附純化一級抗體。如果在不使用初級培養(yǎng)的情況下，你的背景水平不可接受，那么樣本有可能與金綴合物結(jié)合。
背景可能有許多原因，圍繞三種不同類型的相互作用：
通過在蛋白質(zhì)阻斷步驟之前使用NaBH4或氨酸阻斷步驟消除的殘余固定活性，
對疏水區(qū)域的粘性（包埋介質(zhì)、富含脂質(zhì)的樣品化合物）。這通過使用適當?shù)牡鞍踪|(zhì)阻斷步驟來減少，所述蛋白質(zhì)阻斷步驟涉及部分疏水性蛋白質(zhì)，
基于電荷的相互作用導致帶負電荷的試劑（如抗體和金綴合物）粘附在樣品中帶相反電荷的區(qū)域（臭名昭著的是組蛋白、一些膠原類型和聚賴氨酸，有時用于使切片粘在表面）。這種類型的相互作用只能通過向培養(yǎng)基中添加過量的帶負電荷的無關分子來克服。Aurion開發(fā)了一種化學修飾的BSA，稱為BSA-c™ 特別是為此目的。通訊#1提供了深入的信息。新聞稿可在此處在線獲取。
有什么論壇我可以回答關于標簽或顯微鏡的問題嗎？
請隨時通過電子郵件聯(lián)系我們的幫助臺，關于免疫標記的問題。
有一些新聞組可能感興趣，如：生物網(wǎng)。細胞生物、生物網(wǎng)、細胞生物。細胞網(wǎng)，bionet.molbio。方法采用免疫細胞化學和生物化學方法。有一個顯微鏡ListServer，您可以訂閱它，它提供了一個平臺，可以從各個方面詢問有關光學和電子顯微鏡的問題。您可以通過向發(fā)送電子郵件進行訂閱該消息只需包含“訂閱顯微鏡"一詞。
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